布拉德福蛋白质定量法

布拉德福蛋白质定量法(Bradford protein assay),亦称作“考马斯亮蓝法”、“考马斯蓝染色法”(coomassie blue staining),为一种利用光谱学技术分析溶液中蛋白质浓度的技术。本定量法会受待测氨基酸序列影响,此方法为Marion M. Bradford英语Marion M. Bradford医生所开发。

原理

 
左:布拉德福溶液
右:布拉德福溶液+溶菌酶

布拉德福蛋白质定量法为一种利用比色法测定蛋白质浓度的化验法。考马斯亮蓝G-250在酸性环境下,会从红色型态转为蓝色型态,并与蛋白质紧密结合。在形成这个复合物的过程中会经历两种反应:红色态的考马斯亮蓝会先将其自由电子丢给蛋白质的可电离区,造成蛋白质构型改变,并暴露其疏水性区段。于是蛋白质的三级结构会以凡得瓦力与染剂结合。此外,染剂中的负电区会与蛋白质中的正电区相互结合,与蛋白质结合的考马斯亮蓝会因此稳定其蓝色构型,造成溶液颜色改变,此时即可利用光谱仪来测量此变化。

与蛋白结合之后的染料,在一段时间(2 分钟到 1 小时)之内,其吸收光谱图在 595 nm 处有一个最大吸收峰。[1] 染料在与蛋白结合前,以阳离子形态存在,显红色或者绿色;与蛋白结合之后,染料分子的阴离子形态被稳定,显蓝色。染料的吸收光谱在 595 nm 处的吸收峰的增加,正比于结合了蛋白质的染料分子数目,故也正比于样品中蛋白质的数目(浓度)。

布拉德福蛋白质定量法与其它测量蛋白的方法不同,不容易受到蛋白质中其它化学成分的影响。

缺点

此蛋白质分析法会受几种洗涤剂和中性盐的干扰,如SDS,Triton。 结果也取决于所分析蛋白质中氨基酸的种类。

实验方法

实验器材

实验步骤(标准分析,浓度:200-1500 µg/mL)

  1. 准备一纯蛋白质(通常以牛血清蛋白)溶于0.15 M 氯化钠溶液中,稀释浓度为250、500、750和1500 µg/mL。并同时以同浓度稀释待测蛋白质。
  2. 在每个试管加入 100 µL 的稀释蛋白质
  3. 加入 5.0 mL 的考马斯亮蓝G-250到各试管并混合均匀。
  4. 将光谱仪波长调整至 595 nm,并以无蛋白质的一管作为基准。
  5. 5分钟后测量各试管在 595 nm 下的吸光值
  6. 画出标准曲线,计算其吸光系数,并推估蛋白浓度

实验步骤(微量分析,浓度1-10 µg/mL)

替代化验法

其他替代蛋白质化验法还有:

参考文献

  1. ^ Bradford, M. Marion. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976, 72 (1-2): 248-254 [2015-04-16]. PMID 942051. doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3. (原始内容存档于2019-06-14). 

外部链接