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CRISPR

CRISPR（IPA：/ˈkrɪspər/；DJ：/ˈkrispə/；KK：/ˈkrɪspɚ/）是由日本科学家于1987年在大肠杆菌的基因组中发现到特别规律的DNA序列。即某一小段DNA会一直重复，重复片段之间又有相等长的间隔，此序列就是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，简称： CRISPR”亦可称“CRISPR-associated proteins，简称： Cap”[1]；中文各别译为“规律间隔成簇短回文重复序列”[2]和“规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白基因”[3]。

CRISPR是存在于细菌、古菌中的一种基因，该类基因组中含有曾经攻击过该细菌的病毒之基因片段。细菌通过这些基因片段来侦测并抵抗相同病毒的攻击，并摧毁其DNA。这类基因组是细菌免疫系统的关键组成部分。通过这些基因组，人类可以准确且有效地编辑生物体内的部分基因，也就是CRISPR/Cas9基因编辑技术（英语：CRISPR gene editing）。

机制

 
CRISPR可能的机制示意图[4]

CRISPR/Cas系统，为目前发现存在于多数细菌与绝大多数的古菌中的一种后天免疫系统[5]，以消灭外来的质粒或者噬菌体[6][7]，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”[8]。

目前已发现三种不同类型的 CRISPR/Cas系统，存在于大约40%和90%已测序的细菌和古菌中 [9][10]。其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA（gRNA）为核心的组成[11]。

Cas9是第一个被广泛应用的CRISPR核酸酶，其次是Cpf1，其在新泽西弗朗西斯菌（英语：Francisella novicida）的CRISPR/Cpf1系统中被发现[12][13]，而在其它系统中也被认为是存在的[14]。

由于其对DNA干扰（DNAi）的特性，目前被积极地应用于遗传工程中，作为基因体剪辑工具，与锌指核酸酶及类转录激活因子核酸酶同样利用非同源性末端接合的机制，于基因体中产生DNA的双链断裂以利剪辑。第二型 CRISPR/Cas 经由遗传工程的改造应用于哺乳类细胞及斑马鱼的基因体剪辑[15][16]。其设计简单以及操作容易的特性为最大的优点，目前已逐步应用在各种不同的模式生物当中[11]。

发现历史

Cascade
(CRISPR相关病毒防御复合体)
 
crRNA引导的大肠杆菌串级复合体（蓝）与单股DNA（橘）结合的结构
标识
生物 大肠杆菌（Escherichia coli）
符号 CRISPR
Entrez 947229
PDB 4QYZ
RefSeq （蛋白质） NP_417241.1
UniProt P38036
其他数据

聚簇DNA重复的发现始于世界三个地区的三个独立地点。现今称为CRISPR的基因组重复群集，即原核生物拟核DNA链中的丛生重复序列，在1987年一篇由大阪大学石野良纯教授领衔的大肠杆菌研究报告中被首次描述[17]。2000年，相似的重复序列在其它细菌和古菌中被发现，并被命名为“短间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats，SRSR）”[18]。2002年SRSR被重命名为‘CRISPR’，其中一部分基因编码的蛋白为核酸酶和解旋酶，这些“关联蛋白（associated proteins）”与CRISPR一同组成‘CRISPR/Cas系统’[19]。

Cas9

科学家还研究了来自化脓性链球菌的更简单的CRISPR系统，其依赖于蛋白Cas9。Cas9内切核酸酶是包含两个小RNA分子的四组分系统[20]。詹妮弗·杜德纳、埃马纽埃尔·卡彭蒂耶及张锋各自独立的探索CRISPR关联蛋白，了解细菌如何在它们的免疫防御使用间隔（spacer）。他们共同研究一个比较简单的依赖于称为Cas9蛋白的CRISPR系统[21]。

Cpf1

在2015年，核酸酶Cpf1被发现在新泽西弗朗西斯菌（英语：Francisella novicida）的CRISPR/Cpf1系统[12][13]。其他这样的系统被认为存在[14]。Cpf1与Cas9的有几个关键差异，包括： 1. DNA 断裂方式不同：导致双链DNA中的“交错”或“黏性(sticky end)”切割，而不是由Cas9产生的“钝的 (Blunt end)”切割。 2. 相邻间隔原基序（英语：Protospacer adjacent motif）(PAM)不同：Cpf1辨认“富含T碱基”的PAM，而 Cas9 辨认 NGG 为PAM，可为 Cas9 提供替代的标靶序列。 3. 仅需要 CRISPR RNA（crRNA）用于成功标定（使用Cas9同时需要crRNA和一个反向激活crRNA（英语：Trans-activating crRNA）（tracrRNA））。[22]

Cas9n

Cas9n是SpCas9的D10A突变体，只保留了SpCas9两个核酸酶结构域（RuvC和HNH）中的一个来产生DNA切口而不是DSB。因此，需要两个靶向相反的Cas9n才能在靶DNA内产生DSB，这种方法大大提高了靶标特异性，因为不太可能产生两个离靶切口。[23]

应用

用于开发基因敲除和标靶抗癌药物治疗方法，例如囊性纤维化和镰状红细胞贫血症[24]。

评价与获奖

在2012年和2013年，CRISPR是《科学》年度突破的第二名[25]。在2014年和2016年被《麻省理工科技评论》评为10项突破技术之一[26][27]。埃马纽埃尔·夏彭蒂耶与珍妮弗·道德纳因藉CRISPR-Cas9基因编辑技术的研究成果荣获2020年诺贝尔化学奖[28]。

参阅

参考文献

引用列表
  1. ^ CRISPR Associated Protein. sciencedirect. [2024-12-06] （英语）. 
  2. ^ 许文馨. 「上帝的手術刀」誰有權操刀？由CRISPR專利糾葛 看生醫申請案的布局策略. 科学月刊. 2022-05-15 [2024-12-06]. （原始内容存档于2024-07-15） （中文（台湾））. 
  3. ^ 細菌的死亡筆記本—CRISPR/Cas 基因編輯技術. 国家实验研究院. [2024-12-06]. （原始内容存档于2021-06-29） （中文（台湾））. 
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来源列表

延伸阅读

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